文献|人参皂甙Rg3对K562细胞增殖及细胞周期的影响

2017-12-14

文献来源:《实用 医 学 杂 志》 2012 年第 4 期。

作者:肖凤,刘彬,王伴青,方木水,胡玮,孙续禄,朱清仙。


目 的:研究人参皂甙Rg3(ginsenoside,Rg3)对白血病K562细胞的作用及其相关机制。


方 法:将白血病K562细胞分为对照组和Rg3组,Rg3组包括10、20、40、80、100μg/mL组,培养24、48、72 h,四氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖活性(本文结果未列)。再将K562细胞分为对照组和实验组(80μg/mLRg3组),培养24、48、72 h,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)标记实验观察细胞的增殖情况,流式细胞仪分析细胞 24 h、48 h、72 h时细胞周期的变化情况。


结 果:BrdU标记测定显示,免疫细胞化学染色显示白血病K562细胞呈阳性反应,BrdU阳性细胞数分别为:对照组24 h(28.4±3.0)、48 h(31.4±3.3)、72 h(38.1±4.0),Rg3组24 h(22.7±2.5)、48 h (17.3±2.9)、72 h(19.1±1.1),均具有统计学意义(P<0.01);流式细胞仪检测显示:48 h Rg3组细胞周期的G2期增高了3.84倍。


结 论:人参皂甙Rg3可抑制K562细胞增殖,其机制可能与人参皂甙 Rg3将K562细胞周期阻滞在G2期,使细胞不能进行正常的有丝分裂,从而抑制了细胞的增殖有关。


近年研究发现,从人参中提取的皂甙单体成分Rg3 具有显著的抗大肠癌、肺癌和卵巢癌等多种肿瘤生长和转移的作用,且对骨髓、心、肺、肝、肾和神经系统无毒副作用,并与化疗药物联合应用能够起到协同增效的作用[1-3]。其中20(R)-人参皂甙Rg3(简称人参皂甙Rg3)的抗肿瘤作用最为明显[4-5]。白血病的治疗目前仍以传统的大剂量联合化疗为主,而大部分化疗药物对患者免疫系统产生很大的破坏,且存在增加患第二种肿瘤的可能性[6]。本文初步探讨人参皂甙Rg3对K562细胞增殖、凋亡及其细胞周期的影响,为白血病的临床治疗提供实验依据和理论。


1 材料与方法


1.1 材料

K562细胞株(江西省分子医学重点实验室惠赠); 人参皂甙Rg3(购自大连富生制药公司);5-溴脱氧尿嘧啶核苷、抗BrdU及羊抗小鼠FITC(均购自Sigma公司);1640培养基(购自美国GIBG0 公司);DMS0(购自美国Merk公司);小牛血清(购自杭州四季清公司);倒置显微镜(Olympus公司,CKC-TR-2W);流式细胞仪(美国BectonDickinson公司,FACS Calibur)。


1.2 方法

1.2.1 靶细胞和细胞培养[7]

K562细胞用含10%小牛血清的完全1640培养液置于37℃、5%的CO2细胞培养箱中进行常规培养。所有实验均在细胞处于对数生长期时进行。具体步骤参见文献。


1.2.2 细胞增殖检测[8]

K562细胞维持培养时,加入终浓度为16μg/mL的BrdU,按上述条件继续培养72 h;将K562细胞接种于96孔板,分为对照组(正常培养)和Rg3组(80μg/mL),分别继续培养24、48、72 h 后行免疫荧光染色。具体步骤参见文献,并在激发光波长495nm,滤色光波长525nm荧光显微镜下观察,进行阳性细胞计数,图像扫描分析仪分析结果。


1.2.3 流式细胞仪检测[9]

K562细胞接种于96孔板,分为对照组(正常培养)和Rg3组(80μg/mL),分别继续培养24、48、72 h,收集K562细胞于10mL离心管中,1000 r/min离心5 min,去上清,加PBS重悬细胞,洗涤2遍;PBS洗涤后,弃上清,以残留于管底的少量液体将细胞彻底重悬,务必要防止细胞成团。加入1mL的70%预冷乙醇固定,移入1.5mLEp管中,流式细胞仪检测出不同时间点细胞周期各时相的比例。


1.2.4 统计学处理

采用SPSS12.0软件分析,结果以x±s表示,组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。


2 结 果

2.1 人参皂甙Rg3对BrdU阳性细胞表达的影响

BrdU标记测定显示:免疫细胞化学染色显示,白血病K562细胞呈阳性反应,BrdU阳性细胞数分别为对照组24 h(28.4±3.0)、48 h(31.4±3.3)、72 h(38.1±4.0),人参皂甙Rg3组24 h(22.7±2.5)、48 h(17.3±2.9)、72 h(19.1±1.1),均具有统计学意义(P<0. 01)(表1);荧光染色后镜下观察显示,Rg3处理组BrdU标记的细胞数明显比对照组少,细胞体积稍变大(图1)。


注:A,对照组24 hB, 对照组48 hCRg324 hDRg348 h

1  80μgmL Rg3K562细胞增殖的影响


2.2 Rg3对K562细胞细胞周期的影响

流式细胞仪检测培养48h的细胞结果显示,对照组细胞的G1期为32.45%,S期为63.99%,G2期为3.56%,表明K562细胞处于增殖旺盛状态。Rg3组细胞G1期为40.33%,S期为46%,G2期为13.67%,与对照组细胞相比,Rg3处理的K562细胞的G2期比对照组增高了3.84倍,提示Rg3作用K562细胞48h时,能将细胞周期阻滞在G2期,使部分细胞不能进行正常的有丝分裂,从而抑制了K562细胞的增殖(图2、3 和表1)。




3 讨论


近年来大量研究证实多种中药具有诱导细胞凋亡、逆转耐药的作用,并已成为抗肿瘤肿瘤的研究热点[10]。文献资料显示,BrdU为胸腺嘧啶的衍生物,活体注射或加入细胞培养液中,而后利用抗BrdUmAb,显示增殖细胞,可作为反映细胞增殖活性的指标确切可靠[11-12]。我们采用BrdU标记测定,经人参皂甙Rg3作用后,荧光染色图像分析发现K562细胞数量均有不同程度的减少,其中24、48、72 h人参皂甙Rg3组均明显少于对照组。本实验提示,人参皂甙Rg3可抑制K562细胞增殖并诱导细胞凋亡。


人参皂苷Rg3主要作用于细胞增殖周期的G2/M期,诱导肿瘤细胞凋亡,是一种很有效的、通过诱导细胞凋亡而杀死肿瘤细胞的抗肿瘤药物[13-15]我们检测了Rg3处理后K562细胞的细胞周期变化情况。结果发现,Rg3处理K562细胞48 h时,其G2期比对照组增高了3.84倍,表明Rg3将细胞周期阻滞在G2期。G2期也叫DNA合成后期,在G2周期时相,一些与有丝分裂相关的蛋白质,如微丝、微管蛋白、有丝分裂因子等合成结束,为有丝分裂作准备,这提示Rg3阻止了细胞的有丝分裂,最终抑制了细胞的恶性增殖,这与细胞生长曲线所显示的结果相符。


本研究证实,Rg3对白血病细胞的增殖具有明显的抑制作用,并且能诱导白血病细胞凋亡。Rg3具有抗白血病的作用,可能主要是通过人参皂苷Rg3作用于K562细胞增殖周期的G2/M期,抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡实现的。至于Rg3对K562细胞抑制增殖和诱导细胞凋亡[16]作用的具体机制还待进一步的探索。


4 参考文献

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