《人参皂苷Rg3抑制B16黑色素瘤新生血管生成及其机制的探讨》
文献来源：《中华肿瘤防治杂志》
文献作者：辛颖 倪劲松 姜新 崔俊生
目的：观察20(S)-人参皂苷Rg3(SPG-Rg3)对B16黑色素瘤血管生成的影响，并探讨其可能的作用机制。
方法：体内采用肿瘤诱导血管生成实验，观察SPG-Rg3对B16黑色素瘤血管生成的影响;免疫细胞化学法观察SPG-Rg3对B16黑色素瘤细胞血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的影响;取不同浓度SPG-Rg3作用后的B16黑色素瘤细胞条件培养基(BMCM)作用于人脐静脉内皮细胞，用MTT法、PCNA免疫荧光染色以及迁移实验观察SPG-Rg3对内皮细胞增殖和迁移的作用。
结果：在肿瘤诱导血管生成实验中，SPG-Rg3组肿瘤周围的血管数明显少于对照组，P<0.01;SPG-Rg3作用组BMCM的促内皮细胞增殖和迁移作用均明显弱于无SPG-Rg3作用组，且SPG-Rg3(5Lg/mL)降低了B16黑色素瘤细胞VEGF的表达，P<0.01。
结论：SPG-Rg3可明显抑制B16黑色素瘤的血管生成，且可能通过降低肿瘤细胞分泌VEGF来抑制肿瘤细胞对血管内皮细胞增殖和迁移的促进作用，从而达到抑制肿瘤新生血管形成的作用。
人参皂苷Rg3是从红参中提取出来的单体皂苷，属原人参二醇型皂苷，存在两种同分异构体，即20(R)-人参皂苷Rg3(RPG-Rg3)和20(S)-人参皂苷Rg3(SPG-Rg3)。大量研究表明，SPG-Rg3有明显的抑制多种肿瘤生长和转移的作用，其作用与抗肿瘤血管生成密切相关[1-2]。因此，本研究通过体内的肿瘤诱导血管生成实验直接观察SPG-Rg3的抗血管生成作用，并利用SPG-Rg3作用的B16黑色素瘤细胞条件培养基(conditionedmediumofB16melanomacells，BMCM)作用于人脐静脉内皮细胞，在体外进一步探讨其作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
SPG-Rg3系由西洋参中提取，纯度>99.5%，由吉林大学白求恩医学院新药研究室提供;实验动物为清洁级C57BL/6N小鼠20只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，雌雄各半，体质量18~22g，合格批号：SCX4(京)2002-0003;高转移B16黑色素瘤细胞购于上海中科院细胞所，培养于含10%新生牛血清的RPMI1640培养液中;人脐静脉内皮细胞购于Cas-cade公司，培养于含2%低血清生长添加剂(LSGS)的Medinm200培养液中;PCNA、VEGF多克隆抗体及SP试剂盒购于福州迈新生物试剂公司;FITC羊抗兔荧光素购于武汉博士德生物试剂公司;MTT及二甲基亚砜(DMSO)购于Sigma公司;Matrigel胶购于BD公司。
1.2 方法
1.2.1 肿瘤诱导血管生成实验
参考Kreisle等[3]方法，每只小鼠选取背部两点，真皮浅层注入B16黑色素瘤细胞5@105/点，随机均分为4组(对照组、0.3、1.0和3.0mg/kgSPG-Rg3组)，于接种第1、2、3、4和5天分别腹腔注射SPG-Rg3，对照组给予生理盐水，第7天脱颈处死小鼠，分离小鼠背部皮肤，解剖显微镜下(@10)计数朝向瘤体方向生长的血管数。
1.2.2 B16黑色素瘤细胞VEGF免疫细胞化学染色 取对数生长期B16黑色素瘤细胞，按1@105/孔接种于24孔板内培养24h，对照组加入RPMI1640培养液，实验组加入SPG-Rg3，使SPG-Rg3终浓度达5Lg/mL，继续培养24h，用4%多聚甲醇固定，按SP试剂盒说明书进行VEGF免疫组织化学染色，AEC显色，以胞质内出现明显红色者为表达阳性，应用Im-age-ProPlus软件分析表达的灰度值。
1.2.3 BMCM的制备 将B16黑色素瘤细胞3@105接种75mL培养瓶培养，24h后加入SPG-Rg3，使其终浓度分别为0、2.5和5Lg/mL，作用24h后，弃去培养液，PBS洗涤3次，加入1.5mL无血清RP-MI1640继续培养24h，收集的培养基即为BMCM。
1.2.4 MTT法和PCNA免疫荧光染色检测BMCM对内皮细胞增殖的影响 人脐静脉内皮细胞以1@104/孔密度接种于96孔板中培养，24h后弃培养液，加入含4%LSGS的Medium200培养液100LL/孔，分别加入上述BMCM各100LL/孔，阴性对照组为正常培养的内皮细胞(即未加BMCM)，0Lg/mLSPG-Rg3作用组为阳性空白对照组。每组设6个复孔，作用48h后，向各孔内加入MTT溶液20LL(5Lg/mL)，37e、5%CO2孵育4h，终止培养。小心吸弃孔内上清液，每孔加入100LLDMSO，振荡10min，待沉淀完全溶解后在Bio-red550酶标仪上测定吸光度值(OD值)，实验重复3次。同时制备内皮细胞爬片，加入条件和时间同上，4%多聚甲醛固定后行PCNA免疫荧光染色。
1.2.5 BMCM对内皮细胞迁移影响 Matrigel胶用4eRPMI16401B3稀释，铺入Boyden小室，37e、5%CO2孵箱孵育30min，上室加入人脐静脉内皮细胞2@105个，下室加入上述条件培养液200LL，继续孵育5.5h，棉签轻擦去上室面的MatrigeL胶和残留细胞，FAA液固定，HE染色，光学显微镜下(@200)取上、下、左、右、中心5个视野，计数滤膜下面的细胞数，取均值。
1.3 统计学方法
采用SPSS10.0统计软件，计量资料多组间的比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD检验，检验水准A=0105。
2 结果
2.1 SPG-Rg3对B16黑色素瘤血管生成的抑制作用
显微镜观察显示，各组内见多少不等的新生血管朝向瘤体方向生长。对照组、0.3、1.0和3.0mg/kgSPG-Rg3组血管数分别为15.4?1.9、11.5?2.4、4.6?0.7及4.5?0.7，可见SPG-Rg33组瘤周的血管数明显少于对照组，P<0101(图1)，说明SPG-Rg3能抑制B16黑色素瘤血管生成。
图1 C57BL/6N小鼠皮下B16黑色素瘤周血管(@10)
A：对照组;B：3.0mg/kgSPG-Rg3组
2.2 VEGF在B16黑色素瘤细胞中的表达
5.0Lg/mLSPG-Rg3组和对照组的B16黑色素瘤细胞均表达VEGF，经Image-ProPLus软件分析，SPG-Rg3组和对照组灰度值分别为65.96?5.54及104.68?8.34，SPG-Rg3组VEGF的表达明显弱于对照组，P<0.01(图2)，说明SPG-Rg3抑制了黑色素瘤细胞VEGF蛋白的表达。
图2 B16黑色素瘤细胞VEGF免疫细胞化学染色(SP@400)
A：对照组;B：5.0Lg/mLSPG-Rg3组
2.3 MTT法检测SPG-Rg3作用后的BMCM对内皮细胞增殖的影响
阳性空白对照组、2.5、5.0Lg/mLSPG-Rg3组及阴性对照组的OD值分别为0.77?0.06、0.70?0108、0.68?0.03和0.61?0.03。由此可见，阳性空白对照组OD值明显高于阴性对照组，P<0.001，而SPG-Rg3组OD值则明显低于阳性空白对照组，P<0.05;表明无SPG-Rg3作用时，BMCM明显刺激了内皮细胞的增殖，经过SPG-Rg3作用后的BMCM对内皮细胞的促增殖作用则明显减弱。
2.4 SPG-Rg3作用后的BMCM对内皮细胞PCNA表达的影响
免疫荧光染色见阳性对照组、SPG-Rg3作用组和正常内皮细胞PCNA表达的绿色荧光强度依次降低，表明有、无SPG-Rg3作用的BMCM均可刺激内皮细胞增殖，但是经SPG-Rg3作用后的BMCM对内皮细胞增殖的促进作用减弱(图3)。
图3 人脐静脉内皮细胞PCNA免疫荧光染色(@600)
A：阳性对照组;B：5.0Lg/mLSPG-Rg3组;C：阴性对照组
综上所述，本研究进一步证实，人参皂苷SPG-Rg3通过下调肿瘤细胞VEGF的表达，从而抑制血管内皮细胞的增殖和迁移，抑制肿瘤血管生成，进而抑制了B16黑色素瘤的生长和转移。
2.5 SPG-Rg3作用后BMCM对血管内皮细胞迁移的影响
2.5和5.0Lg/mLSPG-Rg3作用组迁移过滤膜的内皮细胞数分别为98.8?13.4和91.6?10.6，明显少于对照组(136.4?16.1，P<0.01，图4)，这表明SPG-Rg3作用后的BMCM对内皮细胞迁移运动的趋化作用明显减弱，SPG-Rg3抑制了内皮细胞的迁移。
图4 内皮细胞迁移穿过Boyden小室滤膜(HE@200)
A：对照组;B：5.0Lg/mLSPG-Rg3组
3 讨论
大量研究表明，人参皂苷Rg3具有明显的抗大肠癌、肺癌和卵巢癌等多种肿瘤生长和转移的作用，并且与化疗药物联合应用能够起到协同增效的作用[4-6]。本研究的前期实验证实，SPG-Rg3具有明显的抗黑色素瘤生长和转移的作用[7]。
有关其抗肿瘤的作用机制，与其抑制肿瘤血管生成、促进肿瘤细胞凋亡以及提高机体免疫力密切相关[6-8]。本实验通过体内皮下接种肿瘤细胞的方式，直接观察到SPG-Rg3的作用以及肿瘤诱导血管新生的情况，进一步证实了SPG-Rg3抗黑色素瘤的作用可能与其抑制B16黑色素瘤血管生成相关，这与Chen等[9]的研究结果相一致。
肿瘤血管生成过程中，内皮细胞增殖、迁移形成管腔，维持血液的流动，其周围的细胞为内皮细胞提供支持并发挥调节作用。内皮细胞作为各种与血管生成相关因素的最终作用点，在肿瘤血管生成过程中起着最为关键的作用。
已有实验证实，内皮细胞的增殖在肿瘤组织中比正常组织中快30~40倍[10]。内皮细胞的分裂增殖是由各种生长因子启动，且多数的生长因子为肿瘤细胞所分泌，其中VEGF是最特异的内皮细胞有丝分裂原[11]，并且其他多种生长因子最终都作用于VEGF。因此，阻断VEGF分泌或VEGF与其受体的相互作用，即可抑制肿瘤中血管内皮细胞的增殖、迁移及最终的血管生成。
已有研究显示，SPG-Rg3可以下调内皮细胞VEGF受体的表达，从而降低VEGF刺激内皮细胞增殖的作用[12]。本研究结果发现，SPG-Rg3下调了B16黑色素瘤细胞VEGF的表达，即可能抑制了VEGF的分泌量，使BMCM中VEGF含量降低，因而对内皮细胞的促增殖作用减弱，即SPG-Rg3间接的抑制了血管内皮细胞的增殖。
此外，肿瘤血管生成不仅与血管内皮细胞分裂增殖相关，也与血管内皮细胞向肿瘤组织迁移密切相关，内皮细胞的迁移能力直接影响到血管生成。内皮细胞迁移运动受多种生长因子调节，如bFGF、PDGF、VEGF和TNF-A[13]等，这些生长因子都可由肿瘤细胞分泌产生，它们与相应的内皮细胞膜上受体结合后促进内皮细胞向趋化因子方向作定向迁移。由于SPG-Rg3下调了B16黑色素瘤细胞VEGF的表达，因此本研究利用Boyden小室观察SPG-Rg3对内皮细胞趋化性运动的影响。结果显示，SPG-Rg3作用后，迁移过滤膜下面的内皮细胞数量明显减少，说明SPG-Rg3降低了BMCM对内皮细胞的趋化作用及内皮细胞的定向迁移能力。
综上所述，本研究进一步证实，人参皂苷SPG-Rg3通过下调肿瘤细胞VEGF的表达，从而抑制血管内皮细胞的增殖和迁移，抑制肿瘤血管生成，进而抑制了B16黑色素瘤的生长和转移。
[参考文献]
[1] 康新梅，张清媛，王恕怀，等.三苯氧胺联合人参皂苷Rg3抑制乳腺癌血管生成的研究[J].肿瘤，2008，28(4)：279-281，287.
[2] YuePY，WongDY，WuPK，etal.Theangiosuppressive effectsof20(R)ginsenosideRg3[J].BiochemPharmacol，2006，72(4)：437-445.
[3] KreisleRA，ErshlerWB.Investigationoftumorangiogenesis
inanidmousemodel：roleofhost-tumorinteractions[J].JNatlCancerInst，1988，80(11)：849-854.
[4] XuTM，CuiMH，XinY，etal.InhibitoryEffectofGinsenosideRg3onOvarianCancerMetastasis[J].ClinMedJ，2008，121(15)：1394-1397.
[5] 丁小文，郑树，彭佳萍，等.人身皂甙Rg3对实验性小鼠大肠肿瘤的预防作用[J].中华肿瘤防治杂志，2006，13(1)：25-28.
[6] XuTM，XinY，CuiMH，etaL.InhibitoryeffectofginsenosideRg3combinedwithcycLophosphamideongrowthandangiogenesisofovariancancer[J].ChinMedJ，2007，120(7)：584-588.
[7] 辛颖，倪劲松，王心蕊，等.20(S)-人参皂苷Rg3抗B16黑色素瘤转移的作用[J].吉林大学学报：医学版，2004，30(4)：540-542.
[8] 陈俊霞，彭惠民，蒲淑萍，等.人参皂苷Rg3诱导膀胱癌细胞系EJ的凋亡作用[J].中国中药杂志，2007，32(16)：78-82.
[9] ChenJ，PengH，Ou-YangX etal.Researchontheantitumor effectofginsenosideRg3inB16melanomacells[J].MeLanomaRes，2008，18(5)：322-329.
[10] FoxSB，GatterKC BicknellRetal.ReLationshipofendothelialcellproliferationtotumorvascularityinhumanbreastcancer[J].CancerRes，1993，58(18)：4161-4163.
[11] FerraraN，Davis-SmythT.Thebiologyofvascularendothelial growthfactor[J].EndocrRev，1997，18(1)：4-25.
[12] 陈明伟，倪磊，赵小革，等.人参皂苷Rg3对肿瘤血管生长调控因子蛋白表达抑制作用的研究[J].中国中药杂志，2005，30(5)：357-360.
[13] SzekaneczZ，ShahMR，HarlowLA，etal.Interleukin-8and tumornecrosisfactor-alphaareinvolvedinhumanaorticendo-theliaLcellmigration.Thepossibleroleofthesecytokinesinhu-manaorticaneurysmalbloodvesselgrowth[J].Pathobiology，1994，62(3)：134-139.
